蛋白實(shí)驗(yàn)檢測(cè)常見問題及解答
       問題1：為什么選擇內(nèi)參？
　　內(nèi)參也叫看家基因，在組織或細(xì)胞中都會(huì)表達(dá)，且表達(dá)量在不同組織或細(xì)胞中幾乎是相同的，一般有α-Tublin，β-actin，GAPDH等，在WesternBlotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參。其作用有二：
　　1.是看提取蛋白質(zhì)量的好壞。如果做western的時(shí)候，內(nèi)參照蛋白有條帶，而目的蛋白沒有，說明蛋白的提取和轉(zhuǎn)膜等步驟沒有問題，是目的蛋白的抗體質(zhì)量不好或者是稀釋倍數(shù)不對(duì)。
　　2.是比較客觀的說明目的蛋白的表達(dá)情況，消除上樣量等的誤差。不同的樣品之間由于蛋白提取的量有差別，可能強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)跑出來(lái)的帶很弱。因此設(shè)立內(nèi)參照，比較不同樣品之間的表達(dá)情況。
　　問題2：為什么檢測(cè)的背景比較高？
　　1.可能抗體濃度濃度較高。
　　2.抗原量較大。
　　3.一張膜中有的目的條帶較弱，為了能讓較弱條帶顯示出來(lái)，曝光時(shí)間較長(zhǎng)。
　　問題3：為什么檢測(cè)無(wú)信號(hào)？（白板）
　　大概總結(jié)為以下幾類原因：
　　1.樣品中目的蛋白豐度很低，低于實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)下限。
　　3.蛋白降解。
　　4.待測(cè)樣品的確為陰性。
　　5.一抗失效。
　　6.抗原量不足，每泳道蛋白上樣量不低于0.1ug。
　　問題4：為什么檢測(cè)的結(jié)果分子量大小與實(shí)際不符？
　　1.翻譯后修飾-比如蛋白的磷酸化，糖基化等，這些都會(huì)增加蛋白的分子量大小。
　　2.翻譯后剪切-比如很多蛋白首先被合成為前體形式，然后通過剪切獲得生物學(xué)活性。
　　3.剪切變異體-相同的基因，經(jīng)過選擇性剪接會(huì)產(chǎn)生不同分子量大小的蛋白。
　　4.相對(duì)電荷-氨基酸的組成（帶電vs不帶電）。
　　5.多聚體-比如蛋白二聚體。