帶您了解一下原位雜交檢測(cè)步驟
　　原位雜交涉及的步驟：玻片的準(zhǔn)備和樣品固定，細(xì)胞或組織的預(yù)滲透處理，靶DNA變性（DNA原位雜交），探針制備，原位雜交過(guò)程，雜交后洗滌，探針（顯色）檢測(cè)。
　　1.玻片的準(zhǔn)備和樣品固定
　　對(duì)于染色體涂片，1：1的乙醇/醚處理的載玻片已能符合要求。對(duì)于組織切片的原位雜交，為了在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不丟失組織樣品，可使用多聚賴氨酸或鉻礬明膠包被的載玻片。
　　樣品的固定步驟是為了保持樣品的原有形態(tài)學(xué)。樣品固定是原位雜交中必不可少的步驟，從化學(xué)反應(yīng)角度來(lái)看，固定劑的使用和選擇對(duì)后續(xù)雜交的影響不會(huì)太大，因?yàn)楹怂犭s交的功能分子基團(tuán)被安全地包裹在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，而交聯(lián)劑的使用對(duì)RNA基本沒(méi)有影響。對(duì)于染色體涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蠟包埋的組織切片用福爾馬林固定。冷凍切片可通過(guò)在4%的甲醛溶液中固定30min，或使用Bouin固定劑。
　　2.樣品預(yù)處理
　　在待測(cè)樣品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹纏繞，根據(jù)不同的細(xì)胞和組織樣品的應(yīng)用，可選擇合適的預(yù)處理方法將靶核酸暴露：
　　內(nèi)源性酶滅活：如果探針的檢測(cè)是通過(guò)酶促法進(jìn)行的，則樣品內(nèi)相應(yīng)的內(nèi)源性酶必須被滅活。如內(nèi)源性的POD可通過(guò)含1%H2O2的甲醛溶液處理30min。如果檢測(cè)酶為AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP檢測(cè)的內(nèi)源性背景一般來(lái)說(shuō)比POD檢測(cè)的低得多，因?yàn)樵陔s交過(guò)程中，樣品中內(nèi)源性AP酶的活性基本都喪失了。
　　RNase處理：在DNA-DNA雜交實(shí)驗(yàn)中，RNase的處理可去除內(nèi)源性RNA，增加實(shí)驗(yàn)的信噪比。在進(jìn)行mRNA為靶標(biāo)的檢測(cè)時(shí)，RNase處理的樣品也可作為質(zhì)控對(duì)照。通常的處理方式是將DNase-free的RNase溶解于2×SSC(100μg/ml)，樣品在溶液中37℃處理60min。
　　SSC=150mMNaCl,15mM檸檬酸鈉溶液(pH7.4)
　　HCl處理：對(duì)樣本進(jìn)行20-30min的200mMHCl處理，可將蛋白抽提，并將核酸序列進(jìn)行一定程度的水解，增加雜交檢測(cè)的信噪比。
　　去垢劑處理：如果對(duì)樣品的固定、脫水、包埋等預(yù)處理過(guò)程不足以將脂膜成分破壞暴露核酸，可對(duì)樣品進(jìn)行額外的蛋白去垢劑處理(如TritonX-100和SDS)。
　　蛋白酶處理：樣品中待雜交的核酸序列常與蛋白纏繞交聯(lián)在一起，樣品的固定步驟更是加劇了蛋白的交聯(lián)程度，因此預(yù)滲透是核酸雜交前的常規(guī)步驟，通常通過(guò)蛋白酶K的消化作用來(lái)完成。根據(jù)不同的文獻(xiàn)來(lái)源，蛋白酶K的工作濃度通常設(shè)為10-500μg/ml(溶解于20mMTris-HCl,2mMCaCl2,pH7.4,酶濃度可根據(jù)具體樣品進(jìn)一步優(yōu)化)，對(duì)樣品進(jìn)行37°C7.5–30min的處理。染色體涂片或核片的蛋白酶K處理濃度可降至1μg/ml消化7.5min。也有文獻(xiàn)指出，福爾馬林固定石蠟包埋的組織切片樣品，使用胃蛋白酶（500μg/ml，溶于200mMHCl）將得到較好的蛋白消化結(jié)果。
　　對(duì)于結(jié)締組織，肝組織等樣品，還可進(jìn)行Collagenase和Dispase的組織消化處理，以降低背景。
　　3.探針制備
　　在進(jìn)行研究前，確定應(yīng)用的探針類型。不同探針類型的優(yōu)劣勢(shì)請(qǐng)見(jiàn)上文描述。DNA探針的制備包括了前期的DNA片段分離純化（或cDNA的克?。┖兔复偬结槝?biāo)記，可選隨機(jī)引物標(biāo)記法和缺口平移法等。RNA探針的制備包括了轉(zhuǎn)錄載體克隆和轉(zhuǎn)錄法探針標(biāo)記。寡核苷酸探針的制備要求先獲得合成的寡核苷酸片段，再進(jìn)行末端標(biāo)記或加尾法探針標(biāo)記。但無(wú)論采用何種標(biāo)記探針及標(biāo)記方法，對(duì)探針標(biāo)記效果需進(jìn)行最終的評(píng)估，并準(zhǔn)確計(jì)算探針濃度。
　　4.原位雜交過(guò)程
　　雜交前可進(jìn)行預(yù)雜交，以防止較高的背景染色。預(yù)雜交條件與雜交條件相同，只是預(yù)雜交液中不含探針和硫酸葡聚糖。
　　靶DNA的變性（對(duì)mRNA的原位雜交無(wú)需此步）
　　樣品DNA的變性在DNA-DNA雜交檢測(cè)中是必須的步驟，但同時(shí)可能會(huì)造成樣品形態(tài)學(xué)的部分破壞，此步是實(shí)驗(yàn)中需要優(yōu)化的一個(gè)步驟。常用的變性方法為堿變性和熱變性，實(shí)驗(yàn)時(shí)可以摸索變性時(shí)間、變性溫度等參數(shù)以獲得最佳條件。
　　如使用熱變性方法，可在雜交時(shí)將探針的變性和樣品DNA變性同步進(jìn)行：將樣品和探針溶液加蓋蓋玻片，置于烘箱80℃變性，染色體DNA樣品處理2min，后冷卻至37℃進(jìn)行雜交。組織樣品DNA的變性時(shí)間可增加至80℃10min。
　　以上就是原位雜交檢測(cè)步驟