淺析COIP的正確操作步驟！小編來(lái)帶你了解一下！
　　一、細(xì)胞的甲醛交聯(lián)與超聲破碎（第一天）
　　1.取出1平皿細(xì)胞（10cm平皿），加入243ul37%甲醛，使得甲醛的終濃度為1%（培養(yǎng)基共有9ml）。
　　2.37℃孵育10min。
　　3.終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中?；靹蚝?，在室溫下放置5min即可。
　　4.吸盡培養(yǎng)基，用冰冷的PBS清洗細(xì)胞2次。
　　5.細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞于15ml離心管中（PBS依次為5ml，3ml和3ml）。預(yù)冷后2000rpm5min收集細(xì)胞。
　　6.倒去上清。按照細(xì)胞量，加入SDSLysisBuffer。使得細(xì)胞終濃度為每200ul含2x106個(gè)細(xì)胞。這樣每100ul溶液含1x106個(gè)細(xì)胞。再加入蛋白酶抑制劑復(fù)合物。假設(shè)MCF7長(zhǎng)滿板為5x106個(gè)細(xì)胞。本次細(xì)胞長(zhǎng)得約為80%。即為4x106個(gè)細(xì)胞。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer。將2管混在一起，共800ul。
　　7.超聲破碎：VCX750，25%功率，4.5s沖擊，9s間隙。共14次。
　　二、除雜及抗體哺育（第一天）
　　1.超聲破碎結(jié)束后，10000g4℃離心10min。去除不溶物質(zhì)。
　　2.留取300ul做實(shí)驗(yàn)，其余保存于-80℃。
　　3.300ul中，100ul加抗體做為實(shí)驗(yàn)組；100ul不加抗體做為對(duì)照組；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M），65℃處理3h解交聯(lián)，跑電泳，檢測(cè)超聲破碎的效果。
　　4.在100ul的超聲破碎產(chǎn)物中，加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC。
　　再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉(zhuǎn)混勻1h。
　　5.1h后，在4℃靜置10min沉淀，700rpm離心1min。
　　6.取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體，另一管中則不加抗體。4℃顛轉(zhuǎn)過(guò)夜。
　　三、檢驗(yàn)超聲破碎的效果（第一天）
　　1.取100ul超聲破碎后產(chǎn)物，加入4ul5MNaCl，65℃處理2h解交聯(lián)。
　　2.分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測(cè)超聲效果。
　　四、COIP免疫復(fù)合物的沉淀及清洗（第二天）
　　1.孵育過(guò)夜后，每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉(zhuǎn)2h。
　　2.4℃靜置10min后，700rpm離心1min。除去上清。
　　3.依次用下列溶液清洗沉淀復(fù)合物。清洗的步驟：加入溶液，在4℃顛轉(zhuǎn)10min，4℃靜置10min沉淀，700rpm離心1min，除去上清。
　　洗滌溶液：
　?。?）lowsaltwashbuffer-onewash
　?。?）highsaltwashbuffer-onewash
　?。?）LiClwashbuffer-onewash
　?。?）TEbuffer-twowash
　　4.清洗完畢后，開始洗脫。
　　洗脫液的配方：100ul10%SDS，100ul1MNaHCO3，800ulddH2O，共1ml。
　　每管加入250ul洗脫buffer，室溫下顛轉(zhuǎn)15min，靜置離心后，收集上清。重復(fù)洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
　　5.解交聯(lián)：每管中加入20ul5MNaCl（NaCl終濃度為0.2M）。
　　6.混勻，65℃解交聯(lián)過(guò)夜。
　　五、DNA樣品的回收（第三天）
　　1.解交聯(lián)結(jié)束后，每管加入1ulRNaseA（MBI），37℃孵育1h。
　　2.每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl（PH6.5），2ul10mg/ml蛋白酶K。45℃處理2h。
　　3.DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ulddH2O。