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DTA負(fù)篩選基因?qū)嶒?yàn):DTA(Diphtheria Toxin A)負(fù)篩選基因是一種常用的遺傳工程工具,主要用于剔除未發(fā)生特定重組事件的細(xì)胞。這種技術(shù)依賴于白喉毒素A鏈(DTA),它能抑制蛋白質(zhì)合成并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在基因打靶實(shí)驗(yàn)中,DTA通常被用來作為負(fù)篩選標(biāo)記,以確保只有那些經(jīng)歷了正確同源重組的細(xì)胞才能存活下來。
藥物誘導(dǎo)基因敲除實(shí)驗(yàn)(如他mo昔芬系統(tǒng)或四環(huán)素系統(tǒng))是在靶基因兩側(cè)插入特定重組酶識(shí)別位點(diǎn)后,通過給藥定時(shí)激活Cre-ER或Tet-On/Tet-Off等重組酶,實(shí)現(xiàn)特定器官、特定時(shí)間點(diǎn)的高效基因刪除,兼顧全身敲除的che底性與條件性敲除的時(shí)空精度,是研究基因功能和藥物靶點(diǎn)驗(yàn)證的利器。
條件性基因敲除實(shí)驗(yàn)借助Cre/loxP或Flp/FRT系統(tǒng),只在特定細(xì)胞類型或發(fā)育階段通過組織特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶切除被loxP/FRT環(huán)繞的目標(biāo)基因,從而規(guī)避胚胎致死、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)時(shí)空敲除,是解析基因功能與疾病機(jī)制的核心遺傳學(xué)工具。
RNA干擾實(shí)驗(yàn)(RNA interference, RNAi)是一種由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象,通過特異性降解目標(biāo)mRNA實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控。
DNA片段的克隆需要合適的載體,載體或是質(zhì)粒,或是噬菌體,或是病毒,通常大多經(jīng)過人工改造。作為載體必須具備兩條件:一是該載體在細(xì)胞內(nèi)必須能自主復(fù)制,即必須具備復(fù)制原點(diǎn);二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn),且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條,保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽(yáng)隆克隆,載體上常有篩選標(biāo)記,如對(duì)抗菌素的抗性,某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。
DNA甲基化通常抑制基因表達(dá),去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。
慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的病毒載體。對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力,可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究中,慢病毒己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一, 并且正在獲得越來越廣泛的應(yīng)用。
生物信息學(xué)(Bioinformatics)是在生命科學(xué)的研究中,利用應(yīng)用數(shù)學(xué)、信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)為工具對(duì)生物信息進(jìn)行儲(chǔ)存、檢索和分析的科學(xué)。
通過非病毒方法將核酸引入真核細(xì)胞的過程定義為轉(zhuǎn)染。使用各種化學(xué),脂質(zhì)或物理方法,該基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是在細(xì)胞背景下研究基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)的有力工具。將外源物質(zhì)導(dǎo)入細(xì)胞的方法主要包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染),電轉(zhuǎn)或者病毒感染。病毒載體是進(jìn)行真核細(xì)胞基因工程、真核基因轉(zhuǎn)染的有力工具。
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